دکتر علی­ اصغر کارخانه
 

بهمن 1391
برای رعایت حریم خصوصی نام نگارنده پایان نامه درج نمی شود

(در فایل دانلودی نام نویسنده موجود است)

تکه هایی از متن پایان نامه به عنوان نمونه :

(ممکن است هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود ولی در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل است)

 فهرست مطالب

صفحه
عنوان
 
فصل اول: مقدمه و مروری بر مطالب گذشته
2
1-1 زیست فناوری
3
2-1 بیوانفورماتیک و نقش آن در زیست­فناوری
3
1-2-1 پایگاه­داده
4
1-1-2-1 جایگاه Expasy
4
2-1-2-1 پایگاه­داده Swiss-Prot
7
3-1-2-1- پایگاه­دادهProsite  یا پایگاه­داده موتیف­ها
9
3-1 کاربرد بیوانفورماتیک در پیش­گویی ساختار پروتئین
9
1-3-1 پیش­گویی ساختار دوم پروتئین­ها
10
2-3-1 پیش­گویی ساختار سوم پروتئین­ها
11
4-1 نمایش ساختار پروتئین
11
5-1 مقایسه ساختار سوم پروتئین­ها
12
6-1 فلزات سنگین و اثرات زیست­محیطی آنها
14
7-1 منابع تولید کننده آلودگی­های فلزات سنگین
16
8-1 کادمیوم
16
9-1 حذف فلزات سنگین از محیط­زیست
17
1-9-1 روش­های فیزیکوشیمیائی
17
1-1-9-1 روش اسمز معکوس
17
2-1-9-1 روش دیالیز الکتریکی
17
3-1-9-1 روش اولترا فیلتراسیون
18
4-1-9-1 تبادل یونی
18
5-1-9-1 رسوب­دهی شیمیایی
18
2-9-1 روشهای پاکسازی زیستی
18
1-2-9-1 پاکسازی گیاهی
18
2-2-9-1 جذب زیستی
19
1-2-2-9-1 سازکار­های جذب زیستی
19
1-1-2-2-9-1 فرایند رسوب و تجمع خارج سلولی
20
1-1-1-2-2-9-1 جذب الکتریکی
20
   2-1-1-2-2-9-1 جذب فیزیکی یا جذب با دخالت نیروهای واندروالس
20
3-1-1-2-2-9-1 جذب شیمیایی
20
2-1-2-2-9-1 رسوب وتجمع داخل سلولی
20
1-2-1-2-2-9-1 متیله­کردن فلز
21
2-2-1-2-2-9-1 سولفوره کردن
21
3-2-1-2-2-9-1 رسوب فلزات مسموم کننده به صورت غیرمستقیم
21
10-1 سازکار­های ورود فلزات سنگین به ریزسازواره­ها
23
11-1 پروتئین­ها و پپتیدهای عمومی متصل شونده به فلزات سنگین
26
12-1 نمایش سطحی باکتریایی
27
1-12-1 نمایش­سطحی در باکتری­های گرم­منفی
29
2-12-1 نمایش پروتئین­های هترولوگ در باکتری­های گرم مثبت
30
13-1 افزایش جذب­زیستی فلزات سنگین در باکتری­های گرم منفی با روش­های مهندسی ژنتیک با تاکید بر نمایش­سطحی
33
14-1 سازکار تشکیل پیلی باکتریایی
36
1-14-1 پیلی­های باکتریایی و پیلی CS3
39
1-1-14-1 سازمان دهی ژنتیکی اپرون Cst
40
2-1-14-1 تنظیم بیان CS3
40
15-1 اهداف تحقیق
 
فصل دوم: مواد و روش­ها
42
1-2 بررسی­های بیوانفورماتیکی
42
1-1-2 پایگاه­های­داده و برنامه­های بیوانفورماتیکی
43
2-1-2 ساختار پروتئین و روش­های پیش­گویی عملکرد
43
1-1-2-1-2 جستجوی (شباهت) در پایگاه­داده توالی 

 
43
1-1-2-1-2 جستجوی (شباهت) در پایگاه­داده توالی
43
3-1-2  روش­های آنالیز ساختار اول
44
4-1-2 روش­ها و برنامه­ی پیش­گویی ساختار و عملکرد پروتئین
46
5-1-2 ابزارهای مشاهده و آنالیز ملکولی
47
2-2 روش­های بیوانفورماتیکی
47
1-2-2 پیش­گویی ساختار دوم
47
2-2-2 پیش­گویی ساختار سوم پروتئین­ها و مدل­سازی
49
1-2-2-2 جستجوی توالی­های مشابه با PSI-Blast و Blast در مقابل پایگاه­داده  PDB
49
2-2-2-2 مدل­سازی مقایسه­ای
49
1-2-2-2-2 سرور SWISS-MODEL
50
2-2-2-2-2 مدل­سازی با برنامه Modeller
51
3-2-2-2 مدل­سازی براساس روش شناسایی تاخوردگی
52
4-2-2-2 شبیه‌سازی دینامیک مولکولی با استفاده از نرم‌افزار GROMACS
52
5-2-2-2 تغییرات RMSD
52
1-5-2-2-2اندازه گیری RMSD با نرم افزار Swiss-Pdb Viewer
53
2-4-2-2-2اندازه­گیری RMSD با برنامه تحت شبکه CE
53
3-2-2 پیش­گویی سطوح در دسترس و سطوح مشترک بین دو پروتئین
54
3-2 مواد
54
1-3-2 ترکیبات استفاده­شده
54
2-3-2 آنتی بیوتیک ها
54
3-3-2 آنتی­بادی­های اولیه
54
4-3-2 آنتی­بادی­های ثانویه
54
5-3-2 باکتری­ها
55
6-3-2 پلاسمیدها
57
7-3-2 اولیگونوکلئوتیدها
58
8-3-2 کیت­های آزمایشگاهی
59
9-3-2 آنزیمها
59
10-3-2 نشانگر­ها
59
11-3-2 محلول­ها و بافرها
60
12-3-2 محیط­های کشت
60
1-12-3-2 محیط­های­کشت CFA آگار
60
13-3-2 محلول‌های مورد نیاز برای تهیه سلول‌های باكتریایی مستعد
60
14-3-2 محلول­های مورد نیاز به منظور نگهداری باکتری­ها
60
4-2 وسایل و دستگاه­ها
61
5-2 روش­ها
61
1-5-2 کشت باکتری
61
2-5-2 استخراج پلاسمید
61
1-2-5-2 استخراج پلاسمید با روش شکستن قلیایی
62
3-5-2 استخراج DNA پلاسمیدی با استفاده از کیت
62
4-5-2 بازیافت قطعات DNA از روی ژل­آگارز با استفاده از کیت
62
6-5-2 تهیه باکتریهای مستعد برای پذیرش DNA پلاسمید خارجی
62
1-6-5-2 مستعد سازی باکتری­ها
63
7-5-2 انتقال پلاسمید به درون باکتری
64
8-5-2 واکنش زنجیره­ای پلی­مراز(Polymerase Chain Reaction, PCR)
64
1-8-5-2 SOEing-PCR (Splicing By Overlap Extension PCR)
67
1-1.                    9-5-2 کلونینگ ژن جهش یافته  CstHدر وکتورpBR322
68
10-5-2 تائید صحت کلون­های واجد پلاسمید نوترکیب (Screening)
69
11-5-2 بررسی پروتیئن­ها
69
1-11-5-2 استخراج پروتیئن پیلی از باکتری
70
2-11-5-2 سنجش پروتیئن به روش برادفورد(Baradford)
70
1-2-11-5-2 رسم منحنی استاندارد پروتئین
71
3-11-5-2 وسترن­بلاتینگ (Western Blotting)
71
4-11-5-2 لکه­گذاری برای سلولهای باکتری
72
12-5-2 رنگ آمیزی ایمینوفلوروسنس
73
13-5-2 بررسی میزان جذب یون فلز
73
14-5-2 ویژگی­های پلاسمیدهای استفاده­شده در این مطالعه
74
15-5-2 بررسی های آماری
 
فصل سوم: نتایج
76
1-3 نتایج بررسی های بیوانفورماتیکی
76
1-1-3 شناسایی و طراحی موتیف(پپتید) متصل شونده به فلزات
80
2-1-3 آنالیز ساختاری پروتئین CstH جهت پیش­گویی جایگاه مجاز در آن
80
1-2-1-3 شناسایی الگو و همردیفی توالی الگو–هدف
87
2-2-1-3 تولید و ساخت مدل و ارزیابی کیفیت آنها
90
3-2-1-3 سطوح قابل دسترس و اسیدهای­آمینه سطحی
93
4-2-1-3 سطوح مشترک و اسیدهای­آمینه درگیر در ارتباطات زیرواحدها در پلیمر پیلی و زیرواحد–چاپرون
94
5-2-1-3 پیش­گویی و تعیین ساختار دوم
96
3-1-3 پیش­گویی نهایی مناطق مجاز در زیرواحد CstH
96
4-1-3 مدل­سازی پروتئین­های هیبرید
98
2-3  نتایج آزمایشگاهی
98
1-2-3  ساخت کاست های ژنی از ترکیب ژن CstH و توالی متصل شونده به کادمیوم
101
2-2-3 کلونینگ DNA زیر­واحد اصلی(CstH) جهش­یافته در وکتور کلونینگ
103
1-2-2-3 غربالگری کلون­های دارای پلاسمید­های نوترکیب
103
1-1-2-2-3 غربالگری با مقاومت آنتی­بیوتیکی و مقایسه وزنی با پلاسمیدهای کنترل
103
2-1-2-2-3 غربالگری با PCR
105
3-1-2-2-3 برش آنزیمی
105
4-1-2-2-3 تعیین توالی ژن­هایCstH::Cbm  وCstH::Cbβm  در کلون­های نوترکیب
106
3-2-3 کلونینگ ژن­هایcstH::Cbm  و CstH::Cbβm در اپرون Cst
108
1-3-2-3 غربال کردن کلون های حاوی اپرون هیبرید Cst::Cbm و  Cst::Cbbm
109
1-1-3-2-3  تائید صحت کلونینگ با برش آنزیمی
110
2-1-3-2-3  تائید کلونیگ با PCR
112
4-2-3 بررسی بیان پیلی­های هیبرید CS3::Cbβm و CS3::Cbm توسط روش­های دات­بلاتینگ باکتری و وسترن پروتئین
113
1-4-2-3 دات بلاتینگ باکتری
114
2-4-2-3 وسترن بلاتینگ
115
5-2-3 بررسی نمایش سطحی پیلی­های هیبرید CS3::Cbβm و CS3::Cbm  توسط رنگ­آمیزی ایمونوفلورسانس
117
6-2-3 بررسی خاصیت اتصال به فلز باکتری­های بیان کننده پیلی CS3 نوترکیب
119
1-6-2-3 جذب کادمیم
120
2-6-2-3 اختصاصیت اتصال
 
فصل چهارم: بحث و نتیجه­گیری
123
1-4 مزیت بیان سطحی بر سایر سیستم­های بیان پروتئین
124
2-4 کاربرد پیلی CS3 جهت نمایش سطحی و نقش مطالعات بیوانفورماتیکی در شناسایی مناطق مجاز ورود پپتیدهای بیگانه در آن
129
3-4 مقایسه موتیف­های طراحی­شده جهت جذب یون کادمیوم توسط باکتری­های نوترکیب ساخته­شده در این پروژه با مطالعات پیشین
135
4-4 پیشنهادات
136
منابع
144
پیوست­ها
 

فهرست جدول­ها

عنوان
صفحه
جدول 1-1. موتیف­های حفظ شده و اختصاصی متصل شونده به یونهای فلزی
8
جدول 1-2. مهمترین صنایع تولید كننده فاضلاب حاوی فلز سنگین
15
جدول 1-3. خانواده­های مهم پروتئین­های دخیل در نقل وانتقالات فلزات سنگین در باکتری­ها
22
جدول1 -4. ارگانل­های سطحی باکتریایی که از طریق مسیر چاپرون-آشر اسمبل می­شوند
35
جدول 1-5. خلاصه ای از اپی توپ­ها و موتیف­های ارائه شده توسط پیلی­ها
38
جدول 2-1. پایگاه­های­داده و برنامه­های بیوانفورماتیکی
42
جدول 2-2.ابزارهای مقایسه توالی
43
جدول 2-3. ابزارهای آنالیز توالی اول پروتئین
43
جدول 2-4. روش­های جستجوی پروفایل و پترن
44
جدول 2-5. ابزارهای پیش­گویی ساختار دوم
44
جدول 2-6. ابزارها و روش های پیش­گویی ساختار سوم
45
جدول 2-7. ابزارهای آنالیز و مشاهده ملکولی
46
جدول 2-8. مشخصات پلاسمیدهای استفاده شده و یا ساخته شده در این

تحقیق
56
جدول 2-9. مشخصات اولیگونوکلئوتید­های استفاده شده در این تحقیق
57
جدول 2-10. ترکیبات استفاده شده در یک واکنش SOEing-PCR
65
جدول 2-11. واكنش برش آنزیمی پلاسمید PPR322
67
جدول 2-12. تركیبات مورد استفاده برای واكنش الحاق
68
جدول 3-1 توالی اسید آمینه ای زیرواحد اصلی و چاپرون دو سیستم CS3 و کپسول آنتی­ژنی F1
81
جدول 3-2. ویژگیهای ساختاری الگو-هدف که توسط روش­های محاسباتی به همراه امتیازات نمره­دهی بدست آمده­است
87
جدول 3-3. مناطق و اسیدهای­آمینه درگیر در ارتباطات ملکولی و غیرقابل دسترس ملکول CstH
94
جدول 3- 4. اثر رقابتی یونهای Ni2+, Cu2+  و Cr3+ بر جذب Cd2+ در حضور کادمیوم
121
4 -1. مقایسه میزان جذب یون کادمیم در سیستم­های نمایش­سطحی مختلف و نتایج حاصل از این تحقیق
133
 

فهرست شکل­ها

عنوان
صفحه
شکل 1-1. بخشی از اطلاعاتی که از پایگاه داده Swiss-Prot برای زیر واحد اصلی پروتیئن  CS3
6
شکل 1-2. برخی از عناصر سنگین مهم در طبیعت
14
شکل 1-3. آرایش عناصر ساختار دوم دومین HMA در پروتئین CadA و  اندرکنش فلز سنگین با اسیدهای آمینه سیسئین موجود در پروتئین ناقل فلز سنگین
23
شکل 1-4. ساختار شیمیایی فیتوچلاتین طبیعی و فیتوچلاتین سنتزشده
26
شکل 1-5. ترکیبات سطحی باکتریهای گرم منفی و گرم مثبت
27
شکل 1-6. عرضه سطحی در باکتریهای گرم منفی
29
شکل 1-7. دیاگرام شمایتک از سرهم بندی پیلی توسط مسیر چاپرون و آشر.
34
شکل 1-8. سازماندهی ژنتیکی لوکوس­های اپرون CS3 ، فلش­ها جهت پروموتر­ها را نشان می­دهد
39
شکل 2-2. خلاصه مراحل مدل­سازی پروتئین­ها
48
شکل 2-3. SOEing-PCR برای وارد کردن موتیف متصل شونده به فلز سنگین در جایگاه مجاز 38 و ساخت وکتور بیانی
66
شکل2-4 .نقشه ژنتیکی پلاسمیدهای دارنده ژن کامل اپرون  Cst  ( PPM4567 )  و ژنcstH  (PPM4555)
74
شکل 3-1. پترن توافقی دومین  اتصال به فلزات سنگین (HMA_1) و  نمایش لوگوی توالی پترن
77
شکل3-2. توالی  و نمودار شماتیک مربوط به دومین HMA _1  در پروتئین CadA
78
شکل 3-3. تطابق توالی بر مبنای ساختار دوم در منطقه انتهای آمینی انواع پروتئین­های دسته P1-Type ATPases
79
شکل 3-4. همردیفی توالی- ساختاری بین پروتئین های الگو-هدف
85
شکل 3-5. همردیفی توالی الگو و هدف زیرواحد اصلی و چاپرون دو پیلی CS3 و F1 Antigen
86
شکل .3-6. مدل­های تولید شده برای دو پروتئین CstH (سمت چپ) و CS3-1
88
شکل 3-7. ارزیابی پایداری دو ملکول CstH  وCS3-1  در طی شبیه سازی دینامیک ملکولی
88
شکل 3-8. بررسی کیفیت مدل های CstH و  Cs3-1توسط سرور تحت شبکه Prosa و نقشه راما چاندران با سرور Procheck
90
شکل 3-9. کاندیدهای جایگاه های مجاز
91
شکل 3-10. آنالیز در معرض قرارگیری مدل CstH با کمک نرم افزار Discovery Studio 2.5
92
شکل 3-11. آنالیز مدل CstH با سرور VADAR
92
شکل 3-12. پیش گویی  پیش­گویی ساختار دوم زیرواحد اصلی پیلی  CstHو موقعیت نسبی مناطق مجاز بر روی آن 

 
95
شکل 3-13. مدل سه بعدی CstH و موقعیت جایگاه های مجاز در آن 

شکل 3-14. مقایسه ساختاری الگوها با مدل هیبرید و آنالیز و بررسی در معرض قرارگیری موتیف متصل شونده به فلز سنگین
96 

97
شکل 3- 15. ساخت کاست های ژنی از ترکیب ژن CstH و توالی متصل شونده به کادمیوم
99
شکل 3–16. الکتروفورز محصولات SOEing-PCR
100
شکل 3-17. نحوه کلونینگ محصولات SOEing PCR در ناقل PBR322
102
شکل 3-18. الکتروفورز DNA پلاسمید PBR322 و کلون­های نوترکیب بر روی ژل آگارز یک درصد
103
شکل 3- 19. الکتروفورز محصولاتPCR  کلون های نوترکیب 

شکل 3-20. الکتروفورز محصول برش آنزیمی DNA نوترکیب با آنزیم­های  AocI و. BamH1
104 

105
شکل3- 21. شکل شماتیک کلونینگ ژن هیبرید CstH::Cbm و  CstH::Cbβm در اپرون پیلی CS3
107
شکل3 -22. برش آنزیمی پلاسمید PPM4567 و پلاسمید­های نوترکیب
108
شکل 3-23. الکتروفورز DNA پلاسمید­های نوترکیب PEYSm2 و PEYSbm2 روی ژل آگارز یک درصد.
109
شکل3-24. الکتروفورز برش آنزیمی DNA پلاسمید­های حامل اپرون نوترکیب با آنزیم HindIII بر روی ژل آگارز یک درصد
110
شکل 3-25. الکتروفورز محصول واکنش PCR کلون­های نوترکیب حامل کل اپرون بر روی ژل آگارز یک درصد.
112
شکل 3-26. دات بلاتینگ باکتری E. Coli بیان کننده پیلی هیبرید با استفاده از آنتی­بادی CS3
113
شکل 3-27. وسترن بلاتینگ باکتری E. Coli بیان کننده پیلی نوترکیب با استفاده از آنتیCS3.
115
شکل 3-28. تصاویر میکروسکوپ فلوئورسانس باکتریE. Coli  بیان کننده پیلی نوترکیب با استفاده از آنتی­بادی CS3
116
شکل 3- 29. منحنی ظرفیت جذب کادمیوم در باکتری بیان کننده موتیف اتصالی به کادمیوم و باکتری E. Coli میزبان
117
شکل 3-30. بررسی اثر عامل زمان بر جذب کادمیوم در باکتری­های مهندسی شده
118
شکل 3-31. مقایسه جذب کادمیوم در سلولهای کنترل و سلولهای نوترکیب
120
شکل 4- 1.  ساختار دمین متصل شونده به فلز واقع در انتهای­آمینی پروتئین CadA باکتری لیستریا مونوسیتوژن و مدل پیشنهادی برای نحوه پیوند فلز با موتیف
128
 
 
 

چکیده:

گسترش فعالیت­های طبیعی و صنعتی در جوامع امروزی منجر به آلودگی اکوسیستم­های آبی و خاکی با فلزات سنگین، ترکیبات معدنی، آلی و رادیونوکلئوئیدها و در نتیجه به مخاطره افتادن حیات اکوسیستم­ها و سلامت انسان شده­است. حضور فلزات سنگین بیش از استاندارهای تعریف شده در محیط باعث بروز مشکلات و عوارض جدی و گاهاً جبران ناپذیر برای انسان و ساکنان آن اکوسیستم می­گردد. لذا می­بایست چاره اندیشی­های جدی در جهت کنترل و حذف آلاینده­ها از بیوسفر بکاربرد.

روش­های مختلفی برای حذف فلزات سنگین و کنترل آنها در محیط و از جمله پسماندهای صنعتی وجود دارد که بطور عمده شامل روش­های فیزیکی (مانند اولترافیلتراسیون و اسمز معکوس)، شیمیایی (از قبیل تبادل یونی و رسوب شیمیایی) و بیولوژیکی (مانند احیای باکتریایی سولفات، حذف گیاهی و حذف و پاکسازی با عرضه سطحی باکتریایی) می­باشند. روشهای بیولوژیکی به سبب مزایایی مانند هزینه پایین، کارایی بالا، عدم نیاز به مواد مغذی فراوان، امکان احیای جاذب و امکان بازیافت فلز مورد توجه بیشتری قرارگرفته ­است.

عرضه سطحی باکتریایی با کمک متدهای DNA نوترکیب روش توانمندی برای ارائه پروتئین­ها و پپتیدهای همولوگ در سطح باکتری­هاست که کاربردهای وسیعی در تهیه و تولید واکسن­های باکتریایی،