دکتر علی اصغر کارخانه
بهمن 1391
برای رعایت حریم خصوصی نام نگارنده پایان نامه درج نمی شود
(در فایل دانلودی نام نویسنده موجود است)
تکه هایی از متن پایان نامه به عنوان نمونه :
(ممکن است هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود ولی در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل است)
فهرست مطالب
صفحه
عنوان
فصل اول: مقدمه و مروری بر مطالب گذشته
2
1-1 زیست فناوری
3
2-1 بیوانفورماتیک و نقش آن در زیستفناوری
3
1-2-1 پایگاهداده
4
1-1-2-1 جایگاه Expasy
4
2-1-2-1 پایگاهداده Swiss-Prot
7
3-1-2-1- پایگاهدادهProsite یا پایگاهداده موتیفها
9
3-1 کاربرد بیوانفورماتیک در پیشگویی ساختار پروتئین
9
1-3-1 پیشگویی ساختار دوم پروتئینها
10
2-3-1 پیشگویی ساختار سوم پروتئینها
11
4-1 نمایش ساختار پروتئین
11
5-1 مقایسه ساختار سوم پروتئینها
12
6-1 فلزات سنگین و اثرات زیستمحیطی آنها
14
7-1 منابع تولید کننده آلودگیهای فلزات سنگین
16
8-1 کادمیوم
16
9-1 حذف فلزات سنگین از محیطزیست
17
1-9-1 روشهای فیزیکوشیمیائی
17
1-1-9-1 روش اسمز معکوس
17
2-1-9-1 روش دیالیز الکتریکی
17
3-1-9-1 روش اولترا فیلتراسیون
18
4-1-9-1 تبادل یونی
18
5-1-9-1 رسوبدهی شیمیایی
18
2-9-1 روشهای پاکسازی زیستی
18
1-2-9-1 پاکسازی گیاهی
18
2-2-9-1 جذب زیستی
19
1-2-2-9-1 سازکارهای جذب زیستی
19
1-1-2-2-9-1 فرایند رسوب و تجمع خارج سلولی
20
1-1-1-2-2-9-1 جذب الکتریکی
20
2-1-1-2-2-9-1 جذب فیزیکی یا جذب با دخالت نیروهای واندروالس
20
3-1-1-2-2-9-1 جذب شیمیایی
20
2-1-2-2-9-1 رسوب وتجمع داخل سلولی
20
1-2-1-2-2-9-1 متیلهکردن فلز
21
2-2-1-2-2-9-1 سولفوره کردن
21
3-2-1-2-2-9-1 رسوب فلزات مسموم کننده به صورت غیرمستقیم
21
10-1 سازکارهای ورود فلزات سنگین به ریزسازوارهها
23
11-1 پروتئینها و پپتیدهای عمومی متصل شونده به فلزات سنگین
26
12-1 نمایش سطحی باکتریایی
27
1-12-1 نمایشسطحی در باکتریهای گرممنفی
29
2-12-1 نمایش پروتئینهای هترولوگ در باکتریهای گرم مثبت
30
13-1 افزایش جذبزیستی فلزات سنگین در باکتریهای گرم منفی با روشهای مهندسی ژنتیک با تاکید بر نمایشسطحی
33
14-1 سازکار تشکیل پیلی باکتریایی
36
1-14-1 پیلیهای باکتریایی و پیلی CS3
39
1-1-14-1 سازمان دهی ژنتیکی اپرون Cst
40
2-1-14-1 تنظیم بیان CS3
40
15-1 اهداف تحقیق
فصل دوم: مواد و روشها
42
1-2 بررسیهای بیوانفورماتیکی
42
1-1-2 پایگاههایداده و برنامههای بیوانفورماتیکی
43
2-1-2 ساختار پروتئین و روشهای پیشگویی عملکرد
43
1-1-2-1-2 جستجوی (شباهت) در پایگاهداده توالی
43
1-1-2-1-2 جستجوی (شباهت) در پایگاهداده توالی
43
3-1-2 روشهای آنالیز ساختار اول
44
4-1-2 روشها و برنامهی پیشگویی ساختار و عملکرد پروتئین
46
5-1-2 ابزارهای مشاهده و آنالیز ملکولی
47
2-2 روشهای بیوانفورماتیکی
47
1-2-2 پیشگویی ساختار دوم
47
2-2-2 پیشگویی ساختار سوم پروتئینها و مدلسازی
49
1-2-2-2 جستجوی توالیهای مشابه با PSI-Blast و Blast در مقابل پایگاهداده PDB
49
2-2-2-2 مدلسازی مقایسهای
49
1-2-2-2-2 سرور SWISS-MODEL
50
2-2-2-2-2 مدلسازی با برنامه Modeller
51
3-2-2-2 مدلسازی براساس روش شناسایی تاخوردگی
52
4-2-2-2 شبیه‌سازی دینامیک مولکولی با استفاده از نرم‌افزار GROMACS
52
5-2-2-2 تغییرات RMSD
52
1-5-2-2-2اندازه گیری RMSD با نرم افزار Swiss-Pdb Viewer
53
2-4-2-2-2اندازهگیری RMSD با برنامه تحت شبکه CE
53
3-2-2 پیشگویی سطوح در دسترس و سطوح مشترک بین دو پروتئین
54
3-2 مواد
54
1-3-2 ترکیبات استفادهشده
54
2-3-2 آنتی بیوتیک ها
54
3-3-2 آنتیبادیهای اولیه
54
4-3-2 آنتیبادیهای ثانویه
54
5-3-2 باکتریها
55
6-3-2 پلاسمیدها
57
7-3-2 اولیگونوکلئوتیدها
58
8-3-2 کیتهای آزمایشگاهی
59
9-3-2 آنزیمها
59
10-3-2 نشانگرها
59
11-3-2 محلولها و بافرها
60
12-3-2 محیطهای کشت
60
1-12-3-2 محیطهایکشت CFA آگار
60
13-3-2 محلولهای مورد نیاز برای تهیه سلولهای باكتریایی مستعد
60
14-3-2 محلولهای مورد نیاز به منظور نگهداری باکتریها
60
4-2 وسایل و دستگاهها
61
5-2 روشها
61
1-5-2 کشت باکتری
61
2-5-2 استخراج پلاسمید
61
1-2-5-2 استخراج پلاسمید با روش شکستن قلیایی
62
3-5-2 استخراج DNA پلاسمیدی با استفاده از کیت
62
4-5-2 بازیافت قطعات DNA از روی ژلآگارز با استفاده از کیت
62
6-5-2 تهیه باکتریهای مستعد برای پذیرش DNA پلاسمید خارجی
62
1-6-5-2 مستعد سازی باکتریها
63
7-5-2 انتقال پلاسمید به درون باکتری
64
8-5-2 واکنش زنجیرهای پلیمراز(Polymerase Chain Reaction, PCR)
64
1-8-5-2 SOEing-PCR (Splicing By Overlap Extension PCR)
67
1-1. 9-5-2 کلونینگ ژن جهش یافته CstHدر وکتورpBR322
68
10-5-2 تائید صحت کلونهای واجد پلاسمید نوترکیب (Screening)
69
11-5-2 بررسی پروتیئنها
69
1-11-5-2 استخراج پروتیئن پیلی از باکتری
70
2-11-5-2 سنجش پروتیئن به روش برادفورد(Baradford)
70
1-2-11-5-2 رسم منحنی استاندارد پروتئین
71
3-11-5-2 وسترنبلاتینگ (Western Blotting)
71
4-11-5-2 لکهگذاری برای سلولهای باکتری
72
12-5-2 رنگ آمیزی ایمینوفلوروسنس
73
13-5-2 بررسی میزان جذب یون فلز
73
14-5-2 ویژگیهای پلاسمیدهای استفادهشده در این مطالعه
74
15-5-2 بررسی های آماری
فصل سوم: نتایج
76
1-3 نتایج بررسی های بیوانفورماتیکی
76
1-1-3 شناسایی و طراحی موتیف(پپتید) متصل شونده به فلزات
80
2-1-3 آنالیز ساختاری پروتئین CstH جهت پیشگویی جایگاه مجاز در آن
80
1-2-1-3 شناسایی الگو و همردیفی توالی الگو–هدف
87
2-2-1-3 تولید و ساخت مدل و ارزیابی کیفیت آنها
90
3-2-1-3 سطوح قابل دسترس و اسیدهایآمینه سطحی
93
4-2-1-3 سطوح مشترک و اسیدهایآمینه درگیر در ارتباطات زیرواحدها در پلیمر پیلی و زیرواحد–چاپرون
94
5-2-1-3 پیشگویی و تعیین ساختار دوم
96
3-1-3 پیشگویی نهایی مناطق مجاز در زیرواحد CstH
96
4-1-3 مدلسازی پروتئینهای هیبرید
98
2-3 نتایج آزمایشگاهی
98
1-2-3 ساخت کاست های ژنی از ترکیب ژن CstH و توالی متصل شونده به کادمیوم
101
2-2-3 کلونینگ DNA زیرواحد اصلی(CstH) جهشیافته در وکتور کلونینگ
103
1-2-2-3 غربالگری کلونهای دارای پلاسمیدهای نوترکیب
103
1-1-2-2-3 غربالگری با مقاومت آنتیبیوتیکی و مقایسه وزنی با پلاسمیدهای کنترل
103
2-1-2-2-3 غربالگری با PCR
105
3-1-2-2-3 برش آنزیمی
105
4-1-2-2-3 تعیین توالی ژنهایCstH::Cbm وCstH::Cbβm در کلونهای نوترکیب
106
3-2-3 کلونینگ ژنهایcstH::Cbm و CstH::Cbβm در اپرون Cst
108
1-3-2-3 غربال کردن کلون های حاوی اپرون هیبرید Cst::Cbm و Cst::Cbbm
109
1-1-3-2-3 تائید صحت کلونینگ با برش آنزیمی
110
2-1-3-2-3 تائید کلونیگ با PCR
112
4-2-3 بررسی بیان پیلیهای هیبرید CS3::Cbβm و CS3::Cbm توسط روشهای داتبلاتینگ باکتری و وسترن پروتئین
113
1-4-2-3 دات بلاتینگ باکتری
114
2-4-2-3 وسترن بلاتینگ
115
5-2-3 بررسی نمایش سطحی پیلیهای هیبرید CS3::Cbβm و CS3::Cbm توسط رنگآمیزی ایمونوفلورسانس
117
6-2-3 بررسی خاصیت اتصال به فلز باکتریهای بیان کننده پیلی CS3 نوترکیب
119
1-6-2-3 جذب کادمیم
120
2-6-2-3 اختصاصیت اتصال
فصل چهارم: بحث و نتیجهگیری
123
1-4 مزیت بیان سطحی بر سایر سیستمهای بیان پروتئین
124
2-4 کاربرد پیلی CS3 جهت نمایش سطحی و نقش مطالعات بیوانفورماتیکی در شناسایی مناطق مجاز ورود پپتیدهای بیگانه در آن
129
3-4 مقایسه موتیفهای طراحیشده جهت جذب یون کادمیوم توسط باکتریهای نوترکیب ساختهشده در این پروژه با مطالعات پیشین
135
4-4 پیشنهادات
136
منابع
144
پیوستها
فهرست جدولها
عنوان
صفحه
جدول 1-1. موتیفهای حفظ شده و اختصاصی متصل شونده به یونهای فلزی
8
جدول 1-2. مهمترین صنایع تولید كننده فاضلاب حاوی فلز سنگین
15
جدول 1-3. خانوادههای مهم پروتئینهای دخیل در نقل وانتقالات فلزات سنگین در باکتریها
22
جدول1 -4. ارگانلهای سطحی باکتریایی که از طریق مسیر چاپرون-آشر اسمبل میشوند
35
جدول 1-5. خلاصه ای از اپی توپها و موتیفهای ارائه شده توسط پیلیها
38
جدول 2-1. پایگاههایداده و برنامههای بیوانفورماتیکی
42
جدول 2-2.ابزارهای مقایسه توالی
43
جدول 2-3. ابزارهای آنالیز توالی اول پروتئین
43
جدول 2-4. روشهای جستجوی پروفایل و پترن
44
جدول 2-5. ابزارهای پیشگویی ساختار دوم
44
جدول 2-6. ابزارها و روش های پیشگویی ساختار سوم
45
جدول 2-7. ابزارهای آنالیز و مشاهده ملکولی
46
جدول 2-8. مشخصات پلاسمیدهای استفاده شده و یا ساخته شده در این
تحقیق
56
جدول 2-9. مشخصات اولیگونوکلئوتیدهای استفاده شده در این تحقیق
57
جدول 2-10. ترکیبات استفاده شده در یک واکنش SOEing-PCR
65
جدول 2-11. واكنش برش آنزیمی پلاسمید PPR322
67
جدول 2-12. تركیبات مورد استفاده برای واكنش الحاق
68
جدول 3-1 توالی اسید آمینه ای زیرواحد اصلی و چاپرون دو سیستم CS3 و کپسول آنتیژنی F1
81
جدول 3-2. ویژگیهای ساختاری الگو-هدف که توسط روشهای محاسباتی به همراه امتیازات نمرهدهی بدست آمدهاست
87
جدول 3-3. مناطق و اسیدهایآمینه درگیر در ارتباطات ملکولی و غیرقابل دسترس ملکول CstH
94
جدول 3- 4. اثر رقابتی یونهای Ni2+, Cu2+ و Cr3+ بر جذب Cd2+ در حضور کادمیوم
121
4 -1. مقایسه میزان جذب یون کادمیم در سیستمهای نمایشسطحی مختلف و نتایج حاصل از این تحقیق
133
فهرست شکلها
عنوان
صفحه
شکل 1-1. بخشی از اطلاعاتی که از پایگاه داده Swiss-Prot برای زیر واحد اصلی پروتیئن CS3
6
شکل 1-2. برخی از عناصر سنگین مهم در طبیعت
14
شکل 1-3. آرایش عناصر ساختار دوم دومین HMA در پروتئین CadA و اندرکنش فلز سنگین با اسیدهای آمینه سیسئین موجود در پروتئین ناقل فلز سنگین
23
شکل 1-4. ساختار شیمیایی فیتوچلاتین طبیعی و فیتوچلاتین سنتزشده
26
شکل 1-5. ترکیبات سطحی باکتریهای گرم منفی و گرم مثبت
27
شکل 1-6. عرضه سطحی در باکتریهای گرم منفی
29
شکل 1-7. دیاگرام شمایتک از سرهم بندی پیلی توسط مسیر چاپرون و آشر.
34
شکل 1-8. سازماندهی ژنتیکی لوکوسهای اپرون CS3 ، فلشها جهت پروموترها را نشان میدهد
39
شکل 2-2. خلاصه مراحل مدلسازی پروتئینها
48
شکل 2-3. SOEing-PCR برای وارد کردن موتیف متصل شونده به فلز سنگین در جایگاه مجاز 38 و ساخت وکتور بیانی
66
شکل2-4 .نقشه ژنتیکی پلاسمیدهای دارنده ژن کامل اپرون Cst ( PPM4567 ) و ژنcstH (PPM4555)
74
شکل 3-1. پترن توافقی دومین اتصال به فلزات سنگین (HMA_1) و نمایش لوگوی توالی پترن
77
شکل3-2. توالی و نمودار شماتیک مربوط به دومین HMA _1 در پروتئین CadA
78
شکل 3-3. تطابق توالی بر مبنای ساختار دوم در منطقه انتهای آمینی انواع پروتئینهای دسته P1-Type ATPases
79
شکل 3-4. همردیفی توالی- ساختاری بین پروتئین های الگو-هدف
85
شکل 3-5. همردیفی توالی الگو و هدف زیرواحد اصلی و چاپرون دو پیلی CS3 و F1 Antigen
86
شکل .3-6. مدلهای تولید شده برای دو پروتئین CstH (سمت چپ) و CS3-1
88
شکل 3-7. ارزیابی پایداری دو ملکول CstH وCS3-1 در طی شبیه سازی دینامیک ملکولی
88
شکل 3-8. بررسی کیفیت مدل های CstH و Cs3-1توسط سرور تحت شبکه Prosa و نقشه راما چاندران با سرور Procheck
90
شکل 3-9. کاندیدهای جایگاه های مجاز
91
شکل 3-10. آنالیز در معرض قرارگیری مدل CstH با کمک نرم افزار Discovery Studio 2.5
92
شکل 3-11. آنالیز مدل CstH با سرور VADAR
92
شکل 3-12. پیش گویی پیشگویی ساختار دوم زیرواحد اصلی پیلی CstHو موقعیت نسبی مناطق مجاز بر روی آن
95
شکل 3-13. مدل سه بعدی CstH و موقعیت جایگاه های مجاز در آن
شکل 3-14. مقایسه ساختاری الگوها با مدل هیبرید و آنالیز و بررسی در معرض قرارگیری موتیف متصل شونده به فلز سنگین
96
97
شکل 3- 15. ساخت کاست های ژنی از ترکیب ژن CstH و توالی متصل شونده به کادمیوم
99
شکل 3–16. الکتروفورز محصولات SOEing-PCR
100
شکل 3-17. نحوه کلونینگ محصولات SOEing PCR در ناقل PBR322
102
شکل 3-18. الکتروفورز DNA پلاسمید PBR322 و کلونهای نوترکیب بر روی ژل آگارز یک درصد
103
شکل 3- 19. الکتروفورز محصولاتPCR کلون های نوترکیب
شکل 3-20. الکتروفورز محصول برش آنزیمی DNA نوترکیب با آنزیمهای AocI و. BamH1
104
105
شکل3- 21. شکل شماتیک کلونینگ ژن هیبرید CstH::Cbm و CstH::Cbβm در اپرون پیلی CS3
107
شکل3 -22. برش آنزیمی پلاسمید PPM4567 و پلاسمیدهای نوترکیب
108
شکل 3-23. الکتروفورز DNA پلاسمیدهای نوترکیب PEYSm2 و PEYSbm2 روی ژل آگارز یک درصد.
109
شکل3-24. الکتروفورز برش آنزیمی DNA پلاسمیدهای حامل اپرون نوترکیب با آنزیم HindIII بر روی ژل آگارز یک درصد
110
شکل 3-25. الکتروفورز محصول واکنش PCR کلونهای نوترکیب حامل کل اپرون بر روی ژل آگارز یک درصد.
112
شکل 3-26. دات بلاتینگ باکتری E. Coli بیان کننده پیلی هیبرید با استفاده از آنتیبادی CS3
113
شکل 3-27. وسترن بلاتینگ باکتری E. Coli بیان کننده پیلی نوترکیب با استفاده از آنتیCS3.
115
شکل 3-28. تصاویر میکروسکوپ فلوئورسانس باکتریE. Coli بیان کننده پیلی نوترکیب با استفاده از آنتیبادی CS3
116
شکل 3- 29. منحنی ظرفیت جذب کادمیوم در باکتری بیان کننده موتیف اتصالی به کادمیوم و باکتری E. Coli میزبان
117
شکل 3-30. بررسی اثر عامل زمان بر جذب کادمیوم در باکتریهای مهندسی شده
118
شکل 3-31. مقایسه جذب کادمیوم در سلولهای کنترل و سلولهای نوترکیب
120
شکل 4- 1. ساختار دمین متصل شونده به فلز واقع در انتهایآمینی پروتئین CadA باکتری لیستریا مونوسیتوژن و مدل پیشنهادی برای نحوه پیوند فلز با موتیف
128
چکیده:
گسترش فعالیتهای طبیعی و صنعتی در جوامع امروزی منجر به آلودگی اکوسیستمهای آبی و خاکی با فلزات سنگین، ترکیبات معدنی، آلی و رادیونوکلئوئیدها و در نتیجه به مخاطره افتادن حیات اکوسیستمها و سلامت انسان شدهاست. حضور فلزات سنگین بیش از استاندارهای تعریف شده در محیط باعث بروز مشکلات و عوارض جدی و گاهاً جبران ناپذیر برای انسان و ساکنان آن اکوسیستم میگردد. لذا میبایست چاره اندیشیهای جدی در جهت کنترل و حذف آلایندهها از بیوسفر بکاربرد.
روشهای مختلفی برای حذف فلزات سنگین و کنترل آنها در محیط و از جمله پسماندهای صنعتی وجود دارد که بطور عمده شامل روشهای فیزیکی (مانند اولترافیلتراسیون و اسمز معکوس)، شیمیایی (از قبیل تبادل یونی و رسوب شیمیایی) و بیولوژیکی (مانند احیای باکتریایی سولفات، حذف گیاهی و حذف و پاکسازی با عرضه سطحی باکتریایی) میباشند. روشهای بیولوژیکی به سبب مزایایی مانند هزینه پایین، کارایی بالا، عدم نیاز به مواد مغذی فراوان، امکان احیای جاذب و امکان بازیافت فلز مورد توجه بیشتری قرارگرفته است.
عرضه سطحی باکتریایی با کمک متدهای DNA نوترکیب روش توانمندی برای ارائه پروتئینها و پپتیدهای همولوگ در سطح باکتریهاست که کاربردهای وسیعی در تهیه و تولید واکسنهای باکتریایی،
